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BD FACSAria Fusion

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BD FACSAriaTM Fusion – Citrometria de Fluxo e Separação celular (cell sorting)


Agência de Fomento: FAPESP (Processo 2015/12894-1) – Equipamento Multiusuário (EMU)

Coordenadora: Profa. Dra. Camila de Oliveira Rodini Pegoraro
Email: carodini@usp.br
Fone: (14) 3226-6126


Comissão de Gestão:

Profa. Dra. Camila de Oliveira Rodini Pegoraro (Coordenadora, FOB/USP)
Prof. Dr. Gustavo Pompermaier Garlet (Pesquisador Associado, FOB/USP)
Profa. Dra. Vanessa Soares Lara (FOB/USP (Pesquisadora Associada, FOB/USP)

Comissão de Usuários:
Prof. Dr. Carlos Ferreira dos Santos (FOB/USP)
Prof. Dr. Rodrigo Cardoso de Oliveira (FOB/USP)
Profa. Dra. Eloiza Helena Tajara da Silva (FAMERP)


Contato:
  
Rafaela Alves da Silva
E-mail: ariafusion@fob.usp.br
Fones: (14) 3235-8378 (Centro Integrado de Pesquisa) e 3226-6142 (Laboratório)
Localização: Laboratório de Citometria de Fluxo e Separação Celular
Departamento de Ciências Biológicas
Faculdade de Odontologia de Bauru – Universidade de São Paulo
Al. Dr. Octavio Pinheiro Brisolla, 9-75
Bauru-SP

 

O que é o sistema Citometria de fluxo?

A citometria de fluxo é uma metodologia que permite a mensuração rápida de parâmetros morfológicos e funcionais de uma grande quantidade de células individuais suspensas em meio líquido. Para isso, as células são inicialmente marcadas com anticorpos (frequentemente monoclonais) conjugados a fluorocromos, que se ligam a proteínas localizadas na superfície ou no interior da célula. Esta suspensão celular é conduzida para o interior do equipamento (câmara de fluxo contínuo) onde fluem em meio líquido, sendo alinhadas em fila única e interceptadas individualmente por uma fonte de excitação luminosa (laser). Ao atingir a célula, a luz é espalhada de acordo com as características morfológicas e estruturais da célula, e o fluorocromo excitado emite raios de luz em comprimento de onda específico e em várias direções, os quais são coletados e convertidos em sinais eletrônicos para análise em softwares específicos.   As medidas da luz fluorescente emitidas pelos marcadores permitem que vários parâmetros ou constituintes celulares possam ser mensurados simultaneamente, utilizando-se vários lasers e diferentes fluorocromos. O BD FACSAria™ Fusion (Figura 1) possui 4 lasers (Azul 488nm, Vermelho 640nm, Violeta 405nm  e Near UV 375nm) (5B/2R/3NUV) com capacidade para análise simultânea de até 12 parâmetros (10 cores, FSC e SSC; Figura 2). Dentre esses parâmetros, incluem-se características físicas das células, como tamanho, volume, granularidade ou complexidade celular, além de análise do conteúdo de DNA e RNA, estudos de viabilidade, proliferação e ciclo celular, atividades enzimáticas, apoptose, quantificação de antígenos de superfície celular (imunofenotipagem) e intracelulares (fatores de transcrição e citocinas), fosforilação de enzimas, citotoxicidade, entre outros.

Figura 1: Citômetro de fluxo e Separador celular BD FACSAria™ Fusion. Fonte: BD Biosciences.

Figura 2: Guia de filtros do Citômetro de fluxo e Separador celular BD FACSAria™ Fusion. Fonte: BD Biosciences.

 

Os dados gerados são apresentados na forma de histograma (Figura 3A) e/ou em gráfico em pontos (histograma bidimensional dot plot, Figura 3B), e representam o número de eventos que são captados após a excitação pelo laser. A análise é realizada graficamente, definindo-se regiões de interesse (gatesP3 e P4, Figura 3B) para os dados registrados, possibilitando investigar subpopulações de interesse (imunofenotipagem).

Figura 3: (A) Quantidade relativa de células positivas e nível de fluorescência para os anticorpos monoclonal pan-específico de camundongo anti-CD44 humano (histograma laranja) e isotipo controle (histograma vazio), após ligação com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com Aloficocianina (APC). Fonte: R&D Systems™, catálogos # MAB7045, # MAB003 e # F0101B, respectivamente). (B) Proporção de células que expressam CD24 e/ou CD44, identificando-se duas subpopulações visualizadas em dois gates distintos, denominadas CD44+/CD24+ (P3, laranja) e CD44+/CD24-/low (P4, azul). Fonte: Leccia et al. Molecular Cancer 2014 13:213.

 

O que é a Separação Celular?

Existem dois tipos de citômetros de fluxo: analisadores e separadores de células. Estes, além de permitirem a realização da análise de diferentes propriedades celulares, possuem a capacidade de isolar as subpopulações específicas de células. Nesse caso, é possível não só a identificação de uma determinada população celular dentre uma suspensão heterogênea de células, mas o isolamento preciso de uma amostra totalmente homogênea, estéril e com viabilidade para ser submetida a diversos ensaios experimentais e metodologias subseqüentes (co-cultivo celular, ensaios de proliferação celular, avaliação genômica, transcriptômica, metabolômica, microscópica ou estudos funcionais, por exemplo). O BD FACSAria™ Fusion tem capacidade de fazer separação (sorting) de até 4 populações celulares diferentes, e ainda depositar automaticamente uma única célula em placas de poços, o que é denominado de Single Cell Sorting ou Clonagem.

 

Regras de utilização

O equipamento BD FACSAria™ Fusion estará disponível para os pesquisadores da FOB-USP, bem como para pesquisadores de outras Instituições, desde que estejam de acordo com as seguintes regras de utilização:

1. O funcionamento do Laboratório de Citometria de Fluxo e Separação Celular ocorre às quintas-feiras, das 8:00 às 17:00;

2. Somente as técnicas responsáveis pelo equipamento poderão manuseá-lo durante os experimentos;

3. Somente será permitida a presença do responsável pelas amostras durante a utilização do equipamento, que acompanhará todos os ajustes e compensações a serem realizados;

4. Materiais de consumo tais como anticorpos, kits, filtros e materiais plásticos serão de responsabilidade de cada pesquisador que utilizará o equipamento. O pessoal técnico fornecerá informações a respeito dos materiais e como adquiri-los;

5. Os experimentos somente serão realizados após os procedimentos de agendamento terem sido finalizados (vide abaixo – link para – Como agendar o uso do BD FACSAria™ Fusion);

6. Será cobrada uma taxa de R$ 100,00 pela primeira hora de utilização do equipamento no ato do agendamento, e R$ 50,00 pela hora adicional ou fração, independente do número de amostras analisadas;

7. É de responsabilidade do pesquisador trazer as amostras necessárias para os ajustes do experimento, seguindo as orientações dadas previamente na entrevista;

8. É obrigatório realizar o procedimento de filtragem das amostras (conforme orientação) alguns minutos antes da aquisição/sorting, com o objetivo de evitar danos no mesmo devido a entupimento;

9. Não é permitido análise de microrganismos (bactérias, fungos e protozoários). Caso a amostra tenha tido contato com alguns desses agentes, é necessário realizar a fixação da amostra com paraformaldeído antes da aquisição;

10. É necessário utilizar os Equipamentos de Segurança Individual (EPIs) durante a permanência na sala do equipamento;

11. Trazer CD ou DVD para gravar os dados brutos referentes ao experimento; não é permitido utilizar pen drive.

12. Não é permitido o uso de:
– iodeto de propídeo
– laranja de acridina/ laranja de tiazol
– 7AAD

 

Como agendar o uso do BD FACSAria™ Fusion?

Para formalizar a utilização do aparelho, os usuários deverão inicialmente realizar um cadastro, informando dados sobre usuário, projeto de pesquisa e experimento (link para – Cadastro). Esses dados serão utilizados para o planejamento dos experimentos e a elaboração dos relatórios de utilização do EMU perante a FAPESP. O usuário deverá, ainda, preencher um termo de compromisso (link para – Termo de compromisso) endereçado à coordenadora do EMU.

Após o preenchimento destes dois documentos, os mesmos deverão ser anexados e enviados para o endereço eletrônico ariafusion@fob.usp.br, com o assunto “Agendamento”. No corpo do e-mail, solicitar o agendamento da entrevista prévia à utilização do equipamento BD FACSAria™ Fusion, que deverá ser realizada com pelo menos 7 dias de antecedência ao experimento. Nessa entrevista, o usuário receberá um treinamento específico receberá uma orientação específica para o preparo das amostras, que será fornecido individualmente pelas técnicas responsáveis pelo EMU, assim como será agendada a data para a realização dos experimentos.

O recolhimento da taxa no valor de R$ 100,00, correspondente à 1 (uma) hora de utilização do equipamento, deverá ser efetuado no ato do agendamento. Caso o tempo utilizado for superior à 1 (uma) hora, posteriormente será cobrado o valor de R$ 50,00 por hora ou fração adicional de utilização do equipamento. Esses valores são independentes do número de amostras analisadas. Os dados bancários, assim como o recibo de serviços de terceiros serão enviados por e-mail. Esta taxa será destinada à criação de um fundo de reserva para eventuais manutenções que tenham que ser realizadas no equipamento.